黄柏PhellodendriChinensisCortex味苦、性寒,为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮,习称“川黄柏”,具有清热燥湿、解毒疗疮、泻火除蒸的功效[1]。黄柏中的化学成分主要有生物碱类、酚酸类、黄酮类以及少量柠檬苦素类化合物[2-6],很多现代药理研究均表明,黄柏具有解热、抗炎抗菌、抗溃疡、降血糖、祛痰镇咳、抗癌和抗血小板聚集等作用,且对免疫系统和心血管也有一定影响,这与其所含化学成分有着十分密切的关系[7-11]。

黄柏的传统炮制加工方法是取干黄柏药材,水处理软化后再切制成黄柏丝干燥。这种加工方法会使黄柏药材在软化过程中造成有效成分的大量流失,导致黄柏的药理药效有所下降。而根据大量文献报道[12-17],药材采用产地加工与炮制一体化的加工方法,可有效降低化学成分损失,提高药效。因此,本实验通过HPLC法,分别测定了产地加工与炮制一体化黄柏和传统黄柏饮片及其盐炙品中绿原酸、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸药根碱、小檗红碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素和黄柏酮9种成分的含量,并对其进行比较,探讨产地加工与炮制一体化黄柏饮片的优势,为提高黄柏饮片质量,减少加工工序和人工、能源消耗,为黄柏的产地加工与炮制一体化的生产提供依据。

1仪器与材料

1.1仪器

Waterse高效液相色谱仪,二极管阵列检测器,美国Waters公司;电子天平,上海瑶新电子科技有限公司;恒温电热套,巩义市予华仪器有限责任公司;DHG-A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;Mettlerae型十万分之一分析天平,瑞士Mettler公司;DFT-型粉碎机,浙江温岭市林大机械有限公司;恒温水浴锅,常州翔天实验仪器厂;四号药典筛,切药刀。

1.2黄柏饮片的制备

黄柏原药材于年3月采自于四川省荥经县,经辽宁中医药大学王冰教授根据《中国药典》年版鉴定为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的树皮。黄柏传统饮片与产地加工一体化饮片均为自制,并根据本课题组前期实验基础所制定的工艺进行制备。

1.2.1传统生黄柏丝取干燥的黄柏树皮,kg黄柏药材使用L水,在室温(20℃)下软化8h,放置室温阴干,即得[18]。

1.2.2传统盐黄柏丝取大小均一,传统方法加工的生黄柏丝放入闷润容器中,喷入盐水,拌匀,密闭闷润2h后取出,置锅中在~℃条件下炒制5min,取出放凉,即得。kg黄柏用盐2kg,其中使用30L水溶解2kg盐[19]。

1.2.3产地加工炮制一体化生黄柏丝采集黄柏树皮,趁鲜切制成2~4mm后干燥,并在烘制温度50~60℃、烘制时长为6h条件下进行干燥[20]。

1.2.4产地加工炮制一体化盐黄柏丝取大小均一,产地加工的生黄柏丝放入闷润容器中,喷入盐水,拌匀,密闭闷润2h后取出,置锅中在~℃条件下炒制5min,取出放凉,即得。kg黄柏用盐2kg,其中使用30L水溶解2kg盐[20]。

1.3试药与试剂

对照品绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮均购自成都曼思特生物科技有限公司,批号分别为MUST-31610、MUST-90710、MUST-40612、MUST-40702、MUST-22614、MUST-22204、MUST-31814、MUST-、MUST-17038,质量分数均≥98%。精纯盐,四川乐山联峰盐化有限责任公司;甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯,其他试剂为分析纯、水为超纯水。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备分别精密称取适量绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮对照品,均置于10mL量瓶中,加甲醇溶解,稀释至刻度,制成质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备

(1)测定绿原酸和生物碱类成分供试品溶液(供试品I)的制备:精密称取传统生黄柏、传统盐黄柏、产地加工炮制一体化生黄柏、产地加工炮制一体化盐黄柏粉末各0.5g,置具塞锥形瓶中,加入1%醋酸-甲醇50mL,称定质量,超声提取(功率W,频率40kHz)40min,取出,放冷,用1%醋酸-甲醇补足减失的质量,摇匀,静置过夜,用0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

(2)测定柠檬苦素和黄柏酮类成分供试品溶液(供试品II)的制备:精密称取传统生黄柏、传统盐黄柏、产地加工炮制一体化生黄柏、产地加工炮制一体化盐黄柏粉末各1.0g,分别置索氏提取器中,加入mL氯仿,加热回流提取5h,提取液滤过,浓缩,遵循少量多次的原则,用乙腈转溶至10mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,用0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液[21],即得。

2.2色谱条件与系统适应性条件

2.2.1绿原酸和生物碱类成分色谱条件与系统适应性色谱柱为WelchC18柱(mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(含0.3%磷酸和0.3%二乙胺),梯度洗脱:0~10min,10%~14%乙腈;10~20min,14%~25%乙腈;20~45min,25%乙腈;检测波长nm;体积流量0.8mL/min;柱温40℃;进样量为10μL,分析时间45min[5]。对照品以及供试品I色谱图见图1。

2.2.2柠檬苦素类成分色谱条件与系统适应性色谱柱为WelchC18柱(mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水-磷酸(45∶55∶0.2);检测波长nm;柱温35℃;体积流量1mL/min;进样量10μL,分析时间30min[5,21]。对照品以及供试品II色谱图见图2。

2.3方法学考察

2.3.1线性范围考察分别精密吸取绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮对照品溶液1、2、4、8、10、20μL,注入高效液相色谱仪,按照“2.2”项下色谱条件测定色谱峰面积,以进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得回归方程。结果见表1。

2.3.2精密度试验精密吸取9种对照品溶液,按照“2.2”项下色谱条件,分别连续进样6次,每次10μL,测定色谱峰面积,结果绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮峰面积的RSD值分别为1.2%、1.3%、2.2%、1.9%、1.7%、1.4%、1.0%、2.4%、1.5%,表明仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验精密吸取同一份“2.1.2”项下方法制备的供试品溶液,按照“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h进样10μL,测定色谱峰面积,结果绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮峰面积的RSD分别为1.2%、0.7%、1.5%、0.6%、1.3%、1.1%、1.4%、0.8%、1.6%,表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.4重复性试验取同一批次的6份产地加工与炮制一体化生黄柏饮片,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件测定,得各成分含量。结果绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮质量分数的RSD分别为1.1%、0.9%、1.6%、0.8%、1.4%、1.8%、1.0%、0.7%、1.3%,表明此方法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验平行取已知各成分含量的黄柏供试品6份,分别精密加入绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱对照品溶液(对照品加入量-样品含量≈1∶1),另平行取已知各成分含量的黄柏供试品6份,分别精密加入柠檬苦素、黄柏酮对照品溶液(对照品加入量-样品含量≈1∶1),分别按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.2”项下色谱条件测定含量,计算加样回收率。得绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮的平均加样回收率(RSD值)分别为95.5%(1.2%)、.7%(2.4%)、98.3%(1.4%)、97.1%(1.3%)、.6%(2.5%)、97.4%(1.5%)、.5%(1.8%)、99.7%(1.7%)、.2%(2.1%),符合相关规定。

2.4含量测定

取传统生黄柏、传统盐黄柏、产地加工炮制一体化生黄柏、产地加工炮制一体化盐黄柏,粉碎成粉,过4号药典筛,按照“2.1.2”项下条件制备供试品溶液,按照“2.2”项下色谱条件测定供试品中绿原酸、木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、小檗红碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素和黄柏酮的含量。结果见表2。

从实验结果可知,传统盐黄柏中绿原酸、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱含量均高于传统生黄柏,木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、柠檬苦素和黄柏酮含量均与传统方法加工生黄柏中相近,且传统盐黄柏中各种成分的含量总和高于传统生黄柏。产地加工炮制一体化盐黄柏中绿原酸、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量均高于产地加工炮制一体化生黄柏,柠檬苦素和黄柏酮含量低于产地加工炮制一体化生黄柏,且产地加工炮制一体化盐黄柏中各种成分的含量总和高于产地加工炮制一体化生黄柏。

产地加工炮制一体化生黄柏与传统生黄柏相比,绿原酸、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱、柠檬苦素和黄柏酮含量均高于传统生黄柏,且各种成分含量总和高于传统生黄柏。产地加工炮制一体化盐黄柏与传统盐黄柏相比,绿原酸、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素和黄柏酮含量均高于传统盐黄柏,且各种成分含量总和高于传统盐黄柏。

综合分析可知,传统盐黄柏饮片中各化学成分含量总和高于传统生黄柏,产地加工炮制一体化黄柏饮片中各化学成分含量总和高于传统黄柏饮片,因此,产地加工炮制一体化黄柏饮片的质量较好,优于传统方法加工的黄柏饮片。

3讨论

实验开始前,对绿原酸和生物碱类成分的检测进行了流动相的考察,分别比较了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-水(0.3%磷酸和0.3%二乙胺)等多个色谱系统[22-23],结果发现使用乙腈-水(0.3%磷酸和0.3%二乙胺)为流动相系统时,分离得到的色谱峰较多,分离效果较好。此外,在此前的实验中,曾预设将黄柏中的生物碱类成分和柠檬苦素类成分通过一个色谱系统进行检测,但多次实验后没有得到理想的分离效果,故在含量测定的实验中将2大类成分分开测定。

从实验结果可知,黄柏盐炙品中有小檗红碱而生品中没有检测到,结合大量文献研究,发现黄柏在加热炮制过程中,因盐酸小檗碱具有一定的热不稳定性,其受热可转化为小檗红碱[19,24-25],从而使小檗红碱含量得以增加。

从含量测定的结果可以看出,与传统方法加工的黄柏饮片相比,产地加工炮制一体化黄柏饮片的各成分含量总和较高,饮片质量较好。说明黄柏饮片在产地加工一体化时,可大量减少有效成分的损失,提高饮片质量。

相对于传统生黄柏饮片的生产,产地加工一体化的黄柏饮片在生产上减少了在制备过程中的水处理软化与重复干燥过程,从而避免由此所引起的有效成分含量的损失,并能降低生产能耗,此外在一体化生产过程中还可以减少多次加工过程中的贮存环节,减少在加工过程中的人力、能源的浪费,进而降低了中药饮片的加工成本[26-27]。而在本课题组的研究过程中产地加工炮制一体化的黄柏饮片中各生物碱、酚酸类及柠檬苦素类成分含量总和高于传统黄柏饮片,此外也对药效学的等效性进行了考察,同样发现产地加工炮制一体化生产的黄柏饮片在体内和体外的药效学抗炎和解热等实验均优于传统方法下炮制的黄柏饮片。于是提示产地加工一体化饮片不仅可以带来工序上的简便,更可以带来更加优质的饮片。本研究结果为产地加工中药饮片一体化生产模式的建立提供研究基础和推广参考。

参考文献(略)

来源:张凡,吴琦,鞠成国,贾天柱.产地加工炮制一体化与传统黄柏饮片的化学成分比较研究[J].中草药,,49(20):-.

                







































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